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                      体外抗体形成细胞检测——液相小室法

                      作者:中华医学网发布时间:2017-10-12 17:37浏览:

                      1、基本原理

                      溶血空斑试验,又称空斑形成细胞(Plague Forming Cell, PFC)试验,是一种体外检测抗体形成细胞的方法。将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔,四天后将小鼠杀死,取脾脏制成脾细胞悬液,内含抗体形成细胞。然后将脾细胞、绵羊红细胞,补体混合孵育。由于PFC所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原抗体复合物,在补体作用下可使红细胞溶解,于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。

                      2、实验材料

                      (1)解剖器械、试管、1ml吸量管;

                      (2)载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器;

                      (3)ICR小鼠(北京大学医学部实验动物中心提供);

                      (4)5%和10%绵羊红血球(SRBC);

                      (5)补体(豚鼠血清,经SRBC吸收,临用时稀释成合适浓度)。

                      3、实验方法

                      (1)小鼠免疫及脾细胞悬液的制备 将5%SRBC (0.4ml)注射于小鼠腹腔,4天后拉脱颈椎处死,取出脾脏放在已加入6ml Hank’s液的平皿中。在100目不锈钢网上研磨,过滤混匀,从中吸取lml加入试管中,加满Hank’s液混匀,离心1000rpm,10分钟。将沉淀的脾细胞恢复lml容积,即为约107/ml浓度的细胞悬液。

                      (2)制作小室 取无脂载玻片(75mm×25mm), 平置桌面上。用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条,然后再覆盖上同样的载玻片,即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边(无需浸入过深,以能封闭小室边缘为准)。

                      (3)小室灌注细胞悬液 取107/ml脾细胞悬液100ml,10%SRBC 200ml,补体 200ml,Hank’s液 1m1混匀后,用尖吸管灌注小室、蜡封、标记、平放于玻片盘内,置37℃孵箱30—45分钟。

                      4、实验结果

                      观察小室内的透明空斑,一个空斑即代表一个空斑形成细胞(PFC),即B细胞。

                      5、注意事项

                      (1)小室注入液体时不要留有气泡;

                      (2)小室边缘需用石蜡封严;

                      (3)37℃孵箱孵育时,必须放平,不可倾斜;

                      (4)观察结果时,应注意辨别空斑与气泡的区别,避免将气泡误认为溶血空斑。